2024年7月4日（周四），中国老年保健协会、一味书院主办的【检验月月坛】系列会议第13期“多方法学助力自身抗体实验室检测”全国直播会在线上如期召开。大连医科大学附属第一医院李士军教授担任大会主席并致辞，辽宁省中医院张程教授，以及青岛市妇女儿童医院宋金莲教授担任本次会议的讲者嘉宾。同时大会还邀请了中国中医科学院广安门医院安成教授、哈尔滨医科大学附属第一医院周海舟教授作为本次会议的讨论嘉宾。几位专家主要围绕“多方法学助力自身抗体实验室检测”进行了深入的交流和讨论。

大连医科大学附属第一医院  李士军教授

       开幕致辞环节，李士军教授对线上各位观众的参与表示欢迎，对本次会议的各位讲者和主持人表示感谢。李士军教授指出自身抗体检测对于自身免疫性疾病的诊断、鉴别诊断、病情评估、治疗监测、预后判断有着非常重要的作用，我国在自身免疫性疾病领域的深耕精作已经取得了瞩目的成绩，检验科已经有能力为自身免疫性疾病的临床实验室诊断提供更加全面、完善的检测方法学和检测项目，目前自身抗体检测有多种方法学，每种方法学都有其独特的应用价值和局限性，今天的主题是多方法学联合助力自身抗体实验室检测，探讨不同类型的自身抗体检测也有不同的检测策略。而每种方法学都有其独特的应用价值和局限性，今天的主题是多方法学联合助力自身抗体实验室检测，探讨不同类型的自身抗体检测也有不同的检测策略。

       学术分享环节，张程教授为大家介绍了常见的自身免疫性疾病以及自身抗体对该疾病诊疗价值。自身免疫性疾病发病隐匿，表现复杂多样，这给疾病诊断带来了极大的困难。而自身抗体的检测能用于辅助疾病的诊断、鉴别诊断，病情评估，判断预后等重要作用，在自身免疫性疾病的诊疗过程起着重要作用。不仅如此，自身抗体检测还对疾病有着预警作用。如定期检测CCP，可以有助于提早发现类风湿关节炎。接下来张程教授介绍了临床中较为常见的自身免疫疾病，如：系统性红斑狼疮、抗磷脂综合征、ANCA相关血管炎、自身免疫性肝病、干燥综合征。张程教授结合指南深入浅出的介绍了这几个疾病的临床症状以及相关抗体的临床应用，令我们受益匪浅。

       紧接着宋金莲教授进行了题为“多方法学助力自身抗体检测”的学术报告。宋教授主要从三个方面展开讲解，分别是自身抗体的临床应用和检测策略、自身抗体检测的方法学概述和检测策略推荐。宋教授利用5个临床病例生动的阐述了自身抗体检测对疾病诊疗的重要性，尤其是对于孕产妇和儿童的诊疗过程中发挥着重要作用。特别是在儿童群体中，系统性红斑狼疮的发病症状并不典型，往往容易误诊、漏诊而耽误治疗。接下来宋教授介绍了目前国内常见的自身抗体检测方法，着重提到了间接免疫荧光、免疫印迹法、酶联免疫吸附法、化学发光法，详细介绍了每种检测方法的优势和局限性。最后宋教授以指南为依据，推荐常见自身抗体检测的策略。宋教授提到对于ANA检测，推荐用间接免疫荧光法进行ANA的总抗体筛查，同时对于ANA的特异性抗体，需要用免疫印迹法、化学发光法等进行靶抗原确认。由此保证ANA靶抗原的全面覆盖及单指标检测的灵敏度，避免漏检。对于抗dsDNA抗体，不但是系统性红斑狼疮的特异性指标，其滴度变化与疾病活动度密切相关，有随访监测的价值。所以针对抗dsDNA抗体检测，可应用间接免疫荧光筛查，同时，ELISA和化学发光法等进行定量监测。对于ANCA是ANCA相关血管炎的重要血清学标志。2017年国际ANCA检测专家共识推荐IIFT和靶抗原确认平行检测或IIFT结果阳性，再进行靶抗原确认。

       学术报告后，李士军教授主持讨论环节，并与各位专家围绕多方法学助力自身抗体实验室检测相关内容进行了深入的交流与分享。李教授结合本次会议的主题，以及线上观众的提问，提出了三个问题：

问题1：目前自身抗体检测的方法众多，其中化学发光自动化程度高，而且定量检测，相比之下其他方法学还有存在的必要性么？

安成教授：从众多文献的报道上来看，其实不同的方法学，在检测的结果上有互补的作用。因为不同的检测方法，它检测的敏感性是完全是不一样的，特异性也不一样，就像宋教授介绍的，每种方法学都有独特的应用价值和局限性。例如间接免疫荧光，是以HEp-2细胞作为检测基质的经典方法学，HEp-2是包含二百余种自身抗体靶抗原的“天然阵列”，以其作为基质对ANA进行IFA检测，敏感性高，是目前公认的ANA检测的金标准，是不能够被其他方法学取代的。以及在指南中，也是推荐多方法学联合检测来降低漏诊、误诊。比如：2018年国内发布的ANCA检测临床应用专家共识推荐以乙醇固定和甲醛固定的中性粒细胞为基质的IIFT筛查及联合ELISA确认靶抗原，可有效提高AAV的临床诊断性能。对于临床疑似AAV患者，可采用ELISA或CLIA直接检测靶抗原PR3和MPO。若检测结果阴性，但临床仍高度怀疑AAV，应使用其他免疫学方法和/或IIFT-ANCA进行重复检测。此外，对于IIFT检测，为了排除ANA的干扰，建议另采用HEp-2细胞+粒细胞（乙醇固定）基质进行辅助检测。

周海舟教授：周教授同样认为化学发光法虽然优势明显，但不能替代其他方法学。周教授举例阐述。第一个例子是PLA2R检测，目前是以间接免疫荧光和酶联免疫吸附法为主要的检测方法。间接免疫荧光使用的是细胞和组织为检测基质，保留了抗原的天然的构象，所以它的敏感度是比较高的。而酶联免疫吸附法检测PLA2R特异性较强。目前梅奥诊所对于检测PLA2R给出的建议是间接免疫荧光和酶联免疫吸附法共同检测，保证了敏感性的同时，提高特异性。第二个例子是自身免疫性皮肤病的相关检测，同样也是间接免疫荧光和四种靶抗原BP180，BP230， Dsg-1和Dsg-3检测同时进行。间接免疫荧光方法学不但敏感性高，还可以区分是基底膜是表皮侧还是真皮侧阳性，但如果是表皮侧阳性的那个提示呢，就是大疱性天疱疮，而真皮侧阳性，就提示是获得性大疱性皮表皮松懈症。而靶抗原检测特异性较高，两者结合不但能降低漏检率，还能明确诊断，同时对临床用药选择有一个很好的提示作用。

问题2：实际工作中，经常会遇到不同方法学结果不一致的情况，对此现象一般如何处理和解决？

安成教授：安教授表示这个问题和第一个问题有一定的相关性。首先不同方法学采用的基质或是抗原是不一样的。间接免疫荧光检测ANA使用的是HEp-2细胞为检测基质，敏感性是很好的。而且不同的核型也提示不同的疾病，对疾病的诊疗有着重要的作用。免疫印迹法、酶联免疫吸附法、化学发光法使用的抗原都是经过人工处理纯化的，特异性很好。作为检验人要把两者结合应用到临床中去。

周海舟教授：周教授表示在实际工作中不仅是自身抗体检测出现这种情况，其他的免疫检测项目也会出现这种情况。常常是同一个患者在不同的医院进行检测，出现检测结果不一致的情况。针对这种情况我建议在复查时尽量在同一家医院进行检测，同时明确检测方法学，以便更换就诊医院时分析比对。最后周教授提出如果检测项目有指南推荐的金标准检测方法，建议出现检测结果按照金标准方法学出报告。比如双链DNA的检测，金标准就是使用绿蝇短膜虫为基质的间接免疫荧光法检测。所以对于双链DNA的检测，如果出现不同检测方法学不一致的情况，建议依据荧光结果来报告。

问题3：自身抗体检测的室内自制质控品如何操作？又如何评价？

安成教授：自身抗体检测的质控品比较难以获得，质控品确实免不了要实验室自制。我们的自制质控品就是从临床上发现的一些样本，然后进行稀释、评价、保存。自制质控品的评价应该包括重复性验证、均匀性验证、稳定性验证等。以膜条印迹的ENA抗体质控为例，会将收集到的不同阳性样本混合在一起进行评价，对一些难获得、低浓度的抗体单独加入反应池中，防止样本混合被稀释而表现阴性。通常在2-8℃短可保存一周，但为了长期使用，需要放在-20℃条件下保存，为了避免反复冻融，可加入甘油，使其在-20℃条件下保持液体状态，甘油的冰点和它的浓度相关，是一个U字形的关系，-25℃的冰点时，甘油的浓度在50%左右，-40℃的冰点时，甘油的浓度大约在60%左右，随后随着甘油浓度增加，冰点反而上升。稳定性可通过破坏实验来验证。

周海舟教授：我们的自制质控品也是使用的临床样本来制作，选择无溶血、黄疸、脂血、乳糜及浑浊等样本，然后进行离心、稀释。用于间接免疫荧光的质控品一般稀释到浓度1:320后进行保存。我们对自制质控品的评价同样包括重复性验证、均匀性验证、稳定性验证这几个方面。

       最后，李士军教授感谢一味书院的大力支持，感谢讲者和讨论嘉宾的精彩分享，感谢线上听众的积极参与和关注，感谢一味书院、欧蒙亚太集团及各位在线工作人员的辛勤付出，至此论坛圆满结束。

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